செய்தி

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) என்பது β-கேலக்டோசிடேஸ் அடி மூலக்கூறின் அனலாக் ஆகும், இது மிகவும் தூண்டக்கூடியது.IPTG இன் தூண்டலின் கீழ், தூண்டியானது அடக்குமுறை புரதத்துடன் ஒரு சிக்கலை உருவாக்க முடியும், அதனால் அடக்குமுறை புரதத்தின் இணக்கம் மாற்றப்படுகிறது, இதனால் இலக்கு மரபணுவுடன் அதை இணைக்க முடியாது, மேலும் இலக்கு மரபணு திறமையாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.சோதனையின் போது IPTG இன் செறிவை எவ்வாறு தீர்மானிக்க வேண்டும்?பெரியது சிறந்ததா?
முதலில், IPTG தூண்டலின் கொள்கையைப் புரிந்துகொள்வோம்: E. coli இன் லாக்டோஸ் ஓபரான் (உறுப்பு) மூன்று கட்டமைப்பு மரபணுக்களைக் கொண்டுள்ளது, Z,Y மற்றும் A, அவை முறையே β-கேலக்டோசிடேஸ், பெர்மீஸ் மற்றும் அசிடைல்ட்ரான்ஸ்ஃபெரேஸ் ஆகியவற்றைக் குறியாக்குகின்றன.lacZ லாக்டோஸை குளுக்கோஸ் மற்றும் கேலக்டோஸ் அல்லது அலோ-லாக்டோஸாக ஹைட்ரோலைஸ் செய்கிறது;lacY சுற்றுச்சூழலில் உள்ள லாக்டோஸ் செல் சவ்வு வழியாக செல்ல அனுமதிக்கிறது மற்றும் செல்லுக்குள் நுழைகிறது;lacA அசிடைல் குழுவை அசிடைல்-CoA இலிருந்து β-கேலக்டோசைடுக்கு மாற்றுகிறது, இதில் நச்சு விளைவை நீக்குகிறது.கூடுதலாக, ஒரு இயக்க வரிசை O, ஒரு தொடக்க வரிசை P மற்றும் ஒரு ஒழுங்குமுறை மரபணு I ஆகியவை உள்ளன. I மரபணு குறியீடு என்பது ஒரு அடக்குமுறை புரதமாகும், இது ஆபரேட்டர் வரிசையின் O நிலைக்கு பிணைக்கப்படலாம், இதனால் ஓபரான் (மெட்டா) ஒடுக்கப்படுகிறது மற்றும் அணைக்கப்பட்டது.கேடபாலிக் ஜீன் ஆக்டிவேட்டர் புரோட்டீன்-சிஏபி பைண்டிங் தளம் தொடங்கும் வரிசையின் மேல்நிலையிலும் உள்ளது. பி வரிசை, ஓ வரிசை மற்றும் சிஏபி பிணைப்பு தளம் ஆகியவை இணைந்து லாக் ஓபரனின் ஒழுங்குமுறைப் பகுதியை உருவாக்குகின்றன.மரபணு தயாரிப்புகளின் ஒருங்கிணைந்த வெளிப்பாட்டை அடைய மூன்று நொதிகளின் குறியீட்டு மரபணுக்கள் ஒரே ஒழுங்குமுறைப் பகுதியால் கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன.

லாக்டோஸ் இல்லாத நிலையில், லாக் ஓபரான் (மெட்டா) அடக்குமுறை நிலையில் உள்ளது.இந்த நேரத்தில், PI புரமோட்டர் வரிசையின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் I வரிசையால் வெளிப்படுத்தப்படும் lac repressor ஆனது O வரிசையுடன் பிணைக்கிறது, இது RNA பாலிமரேஸை P வரிசையுடன் பிணைப்பதைத் தடுக்கிறது மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் துவக்கத்தைத் தடுக்கிறது;லாக்டோஸ் இருக்கும்போது, ​​லாக் ஓபரான் (மெட்டா) தூண்டப்படலாம் இந்த ஓபரான் (மெட்டா) அமைப்பில், உண்மையான தூண்டியானது லாக்டோஸ் அல்ல.லாக்டோஸ் செல்லுக்குள் நுழைந்து β-கேலக்டோசிடேஸால் வினையூக்கி அலோலாக்டோஸாக மாற்றப்படுகிறது.பிந்தையது, ஒரு தூண்டி மூலக்கூறாக, அடக்குமுறை புரதத்துடன் பிணைக்கிறது மற்றும் புரத இணக்கத்தை மாற்றுகிறது, இது O வரிசை மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனில் இருந்து ஒடுக்குமுறை புரதத்தின் விலகலுக்கு வழிவகுக்கிறது.Isopropylthiogalactoside (IPTG) அலோலாக்டோஸ் போன்ற அதே விளைவைக் கொண்டுள்ளது.இது மிகவும் சக்திவாய்ந்த தூண்டியாகும், இது பாக்டீரியாவால் வளர்சிதைமாற்றம் செய்யப்படவில்லை மற்றும் மிகவும் நிலையானது, எனவே இது ஆய்வகங்களில் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.

IPTG இன் உகந்த செறிவை எவ்வாறு தீர்மானிப்பது?ஈ.கோலியை உதாரணமாக எடுத்துக் கொள்ளுங்கள்.
E. coli BL21 மரபணு ரீதியாக வடிவமைக்கப்பட்ட விகாரமானது நேர்மறை மறுசீரமைப்பு pGEX (CGRP/msCT) ஐக் கொண்ட 50μg·mL-1 ஆம்ப் கொண்ட LB திரவ ஊடகத்தில் உட்செலுத்தப்பட்டது, மேலும் 37°C இல் ஒரே இரவில் வளர்க்கப்பட்டது.மேலே உள்ள கலாச்சாரம், விரிவாக்க கலாச்சாரத்திற்காக 1:100 என்ற விகிதத்தில் 50μg·mL-1 Amp கொண்ட 50mL புதிய LB திரவ ஊடகத்தின் 10 பாட்டில்களில் செலுத்தப்பட்டது, மேலும் OD600 மதிப்பு 0.6~0.8 ஆக இருந்தபோது, ​​IPTG இறுதி செறிவில் சேர்க்கப்பட்டது.இது 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ஆகும்.அதே வெப்பநிலை மற்றும் அதே நேரத்தில் தூண்டலுக்குப் பிறகு, அதிலிருந்து 1 மில்லி பாக்டீரியா கரைசல் எடுக்கப்பட்டது, மேலும் பாக்டீரியா செல்கள் மையவிலக்கு மூலம் சேகரிக்கப்பட்டு புரத வெளிப்பாட்டின் வெவ்வேறு IPTG செறிவுகளின் தாக்கத்தை பகுப்பாய்வு செய்ய SDS-PAGE க்கு உட்படுத்தப்பட்டன, பின்னர் மிகப்பெரிய புரத வெளிப்பாட்டுடன் IPTG செறிவைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.
சோதனைகளுக்குப் பிறகு, IPTG இன் செறிவு முடிந்தவரை பெரியதாக இல்லை என்று கண்டறியப்படும்.IPTG பாக்டீரியாவுக்கு ஒரு குறிப்பிட்ட நச்சுத்தன்மையைக் கொண்டிருப்பதே இதற்குக் காரணம்.செறிவை மீறுவது செல்லையும் கொல்லும்;மற்றும் பொதுவாகச் சொன்னால், கலத்தில் எவ்வளவு கரையக்கூடிய புரதம் வெளிப்படுத்தப்படுகிறதோ, அவ்வளவு சிறந்தது என்று நம்புகிறோம், ஆனால் பல சந்தர்ப்பங்களில் IPTG இன் செறிவு அதிகமாக இருக்கும்போது, ​​ஒரு பெரிய அளவு சேர்க்கை உருவாகும்.உடல், ஆனால் கரையக்கூடிய புரதத்தின் அளவு குறைந்தது.எனவே, மிகவும் பொருத்தமான IPTG செறிவு பெரும்பாலும் பெரியதாக இல்லை, ஆனால் குறைந்த செறிவு.
மரபணு ரீதியாக வடிவமைக்கப்பட்ட விகாரங்களின் தூண்டல் மற்றும் சாகுபடியின் நோக்கம் இலக்கு புரதத்தின் விளைச்சலை அதிகரிப்பது மற்றும் செலவுகளைக் குறைப்பதாகும்.இலக்கு மரபணுவின் வெளிப்பாடு திரிபுகளின் சொந்த காரணிகள் மற்றும் வெளிப்பாடு பிளாஸ்மிட் ஆகியவற்றால் மட்டுமல்ல, தூண்டியின் செறிவு, தூண்டல் வெப்பநிலை மற்றும் தூண்டல் நேரம் போன்ற பிற வெளிப்புற நிலைமைகளாலும் பாதிக்கப்படுகிறது.எனவே, பொதுவாக, அறியப்படாத புரதம் வெளிப்படுத்தப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்படுவதற்கு முன்பு, பொருத்தமான நிலைமைகளைத் தேர்ந்தெடுத்து சிறந்த சோதனை முடிவுகளைப் பெற தூண்டல் நேரம், வெப்பநிலை மற்றும் IPTG செறிவு ஆகியவற்றைப் படிப்பது சிறந்தது.