தயாரிப்புகள்

கொலிசின் E1 சேனல் டொமைனின் சவ்வு இடவியல் ஃப்ளோரசன்ஸ் அதிர்வு ஆற்றல் பரிமாற்றத்தால் (FRET) ஆய்வு செய்யப்பட்டது.FRET ஆனது மரபணு குறியிடப்பட்ட ஃப்ளோரசன்ட் அமினோ அமிலத்தை (கூமரின்) நன்கொடையாக உள்ளடக்கியது மற்றும் FRET ஏற்பியாக DABMI (4-(dimethylamino) phenylazophenyl-4'-maleimide) உடன் இணைக்கப்பட்ட தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட லேபிளிடப்பட்ட சிஸ்டைன் எச்சம்.ஃப்ளோரசன்ட் கூமரின் எச்சம் ஒரு ஆர்த்தோகனல் டிஆர்என்ஏ/அமினோஅசில்-டிஆர்என்ஏ சின்தேடேஸ் ஜோடி வழியாக புரதத்தில் இணைக்கப்பட்டது, இது கொலிசின் சேனல் டொமைனில் உள்ள எந்த தளத்திலும் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஒருங்கிணைப்பை அனுமதித்தது.ஒவ்வொரு மாறுபாடும் கூமரின் ஒருங்கிணைப்புக்கான நிறுத்தம் (TAG) பிறழ்வையும், DABMI இணைப்புக்கான சிஸ்டைன் (TGT) பிறழ்வையும் கொண்டுள்ளது.கரையக்கூடிய மற்றும் சவ்வு-பிணைப்பு நிலைகளுக்கு FRET பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி ஹெலிகள் 1-6க்குள் ஆறு இடைநிலை தூரங்கள் தீர்மானிக்கப்பட்டது.சேனல் டொமைனின் சவ்வு-பிணைப்பு கட்டமைப்பில் புதிய நுண்ணறிவை வழங்கும் சவ்வு சங்கத்தின் மீது ஹெலிகள் 3-6 இடையேயான இடைநிலை தூரங்களில் FRET தரவு பெரிய மாற்றங்களைக் காட்டியது.பொதுவாக, coumarin-DABMI FRET இன்டர்ஹெலிகல் செயல்திறன் சவ்வு பிணைப்பில் குறைந்து, கொலிசின் சேனலுக்கான குடை மாதிரியை உருவாக்குகிறது.சேனல் டொமைனின் மூடிய நிலைக்கான ஒரு தற்காலிக மாதிரி தற்போதைய மற்றும் முன்பு வெளியிடப்பட்ட FRET தரவின் அடிப்படையில் உருவாக்கப்பட்டது.ஹெலிகள் 8 மற்றும் 9 மூலம் உருவாக்கப்பட்ட மத்திய டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் ஹேர்பின்னைச் சுற்றி 1, 6, 7, மற்றும் 10 ஹெலிகளின் சவ்வு இடைமுக சங்கம் மற்றும் புற-செல்லுலார் பக்கத்திலிருந்து கடிகார திசையில் 1-7 ஹெலிகளின் வட்ட அமைப்பை பரிந்துரைக்கிறது.